RNA methodologies:a laboratory guide for isolation and characterization

目录
第1章 RNA与细胞生物学
1.1 为什么研究RNA
1.2 RNA是什么
1.3 多核苷酸的合成
1.4 RNA的种类
1.5 严谨度——影响核酸结构的条件
1.5.1 盐对严谨度的影响
1.5.2 pH对严谨度的影响
1.5.3 温度对严谨度的影响
1.5.4 甲酰胺对严谨度的影响
1.6 双链分子的类型
1.7 参考文献
第2章 真核基因的转录与组织
2.1 转录和中心法则
2.1.1 调控元件
2.1.2 DNA模板
2.2 基因组织
2.3 RNA聚合酶和转录产物
2.4 参考文献
第3章 信使RNA
3.1 典型mRNA分子的拓扑结构
3.1.1 5′帽子
3.1.2 前导序列
3.1.3 编码区
3.1.4 尾部序列
3.1.5 聚腺苷尾
3.1.6 细胞器mRNA
3.2 细胞质内的稳定性
3.3 调控水平
3.4 参考文献
第4章 核糖核酸酶
4.1 基本原理
4.2 核糖核酸酶活性的消除
4.3 核糖核酸酶抑制剂的种类
4.3.1 特异性RNase抑制剂
4.3.2 非特异性RNase抑制剂
4.4 器皿和试剂的准备
4.4.1 二乙基焦碳酸酯
4.4.2 替代方法——用消毒水冲洗
4.4.3 过氧化氢
4.4.4 氢氧化钠和十二烷基硫酸钠
4.5 控制核酸酶活性的其他试剂
4.5.1 盐酸胍
4.5.2 硫氰酸胍
4.5.3 十二烷基硫酸钠
4.5.4 N-十二烷基肌氨酸钠
4.5.5 苯酚∶氯仿∶异戊醇
4.5.6 8-羟基喹啉
4.5.7 氯化铯
4.5.8 三氟乙酸铯
4.5.9 蛋白酶K
4.5.10 RNAlater(RNA保护剂)
4.6 实验方案:氧钒核糖核苷复合物的合成
4.7 参考文献
第5章 RNA分离策略
5.1 基本原理
5.2 RNA纯化的目的
5.3 裂解缓冲液的组成
5.3.1 温和的裂解缓冲液
5.3.2 离液裂解缓冲液
5.4 用含有胍离子的缓冲液分离RNA
5.5 胍-酸-酚抽提技术
5.5.1 实验方案:胍-酸-酚抽提
5.6 密度梯度离心
5.6.1 氯化铯
5.6.2 三氟乙酸铯
5.7 同时分离RNA和DNA
5.7.1 实验方案:同时分离RNA和DNA
5.8 试剂盒
5.8.1 硅胶技术
5.9 其他方法
5.9.1 实验方案:用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA
5.9.2 实验方案:原核RNA的分离
5.9.3 实验方案:酵母RNA的分离
5.10 纯化RNA的短期保存和长期保存
5.11 参考文献
第6章 从组织中提取RNA
6.1 基本原理
6.2 组织培养或组织
6.2.1 细胞培养的优点
6.2.2 组织样品的优点
6.3 匀浆方法
6.3.1 Polytron破碎
6.3.2 杜恩斯匀浆
6.4 从不同器官和组织分离RNA的方法
6.4.1 新鲜组织
6.4.2 冷冻组织
6.4.3 固定组织
6.5 实验方案:用氯化锂-尿素法从组织分离RNA
6.6 实验方案:从富含脂类的组织分离RNA
6.7 纯化嵌合在多核糖体的mRNA
6.7.1 实验方案:嵌入多核糖体的mRNA的提取
6.8 实地采集生物样品
6.9 RNA“净化”方法
6.10 参考文献
第7章 多聚腺苷酸RNA的分离
7.1 基本原理
7.2 多聚腺苷酸化
7.3 poly(A)的解释说明
7.4 多聚腺苷酸化mRNA的分离
7.5 用磁珠技术纯化poly(A)?RNA
7.5.1 实验方案:用磁珠纯化poly(A)?RNA
7.6 oligo(dT)-纤维素柱层析
7.6.1 实验方案:生理量的poly(A)?RNA纯化
7.7 快速非柱式纯化poly(A)?RNA
7.7.1 实验方案:快速非柱式纯化poly(A)?RNA
7.8 参考文献
第8章 RNA制备的质量控制
8.1 基本原理
8.2 质量控制技术1:RNA的电泳检测
8.2.1 实验方案
8.3 质量控制技术2:紫外吸收光谱和吸收峰比值
8.3.1 核酸浓度和纯度的鉴定
8.4 质量控制技术3:RNA样品进行RT-PCR
8.5 质量控制技术4:Northern分析
8.6 质量控制技术5:RNA样品进行体外翻译
8.7 参考文献
第9章 斑点印迹分析
9.1 基本原理
9.2 斑点印迹的优点和缺点
9.3 合适的阴性对照和阳性对照
9.3.1 实验方案:RNA斑点印迹
9.3.2 实验方案:DNA斑点印迹
9.4 斑点印迹数据的局限性
9.5 参考文献
第10章 电泳
10.1 基本原理
10.2 核酸的标准化
10.2.1 实验方案:poly(A)的标准化
10.3 琼脂糖凝胶电泳中RNA样品变性方法
10.3.1 甲醛变性法
10.3.2 实验方案:甲醛变性胶
10.3.3 乙二醛/二甲基亚砜变性法
10.3.4 实验方案:乙二醛化与RNA电泳
10.4 分子量标准
10.4.1 分子量标准的正确使用
10.4.2 核糖体RNA
10.5 凝胶染色技术
10.5.1 溴化乙锭
10.5.2 SYBR绿
10.5.3 SYBR金
10.5.4 GelStar
10.5.5 银染
10.5.6 吖啶橙
10.5.7 亚甲基蓝
10.6 电泳过程中的安全问题
10.7 电泳仪器的维护
10.8 第一次进行琼脂糖凝胶电泳时的几点提示
10.8.1 基本术语
10.8.2 注意事项
10.9 参考文献
第11章 照片文档和图像分析
11.1 基本原理
11.2 照片文档
11.2.1 样本可视化
11.2.2 色彩过滤
11.2.3 安全第一
11.2.4 优化电泳图的一些小技巧
11.2.5 照相技术和X射线胶片固有的局限性
11.3 数字图像分析
11.3.1 图像格式
11.3.2 实践中需要考虑的问题
11.4 参考文献
第12章 Northern印迹分析
12.1 基本原理
12.2 滤膜的选取
12.2.1 硝酸纤维素膜
12.2.2 尼龙膜
12.2.3 聚偏二氟乙烯膜
12.3 膜的准备和取用
12.4 Northern转膜技术
12.4.1 毛细转膜法
12.4.2 涡轮印迹器
12.4.3 真空印迹法
12.4.4 正压转膜法
12.4.5 电转印迹法
12.4.6 碱印迹法
12.4.7 实验方案:用被动毛细扩散法转移RNA
12.4.8 实验方案:用涡轮印迹器向下转移RNA
12.5 转膜后膜的处理
12.5.1 甲醛变性系统
12.5.2 乙二醛变性系统
12.6 固定技术
12.6.1 烘烤
12.6.2 紫外线照射交联
12.6.3 实验方案:将RNA紫外交联于尼龙膜上
12.7 固定后膜的处理
12.8 参考文献
第13章 核酸探针技术
13.1 基本原理
13.2 探针的分类
13.3 标记系统的选择
13.3.1 同位素标记
13.3.2 非同位素标记
13.4 DNA探针
13.4.1 DNA探针的合成
13.5 反义RNA探针
13.5.1 RNA探针的特点
13.5.2 RNA探针的合成
13.6 探针的纯化
13.7 探针的保存
13.8 内源参照物
13.9 参考文献
第14章 核酸杂交应用
14.1 基本原理
14.2 影响杂交动力学和特异性的因素
14.2.1 温度
14.2.2 离子强度
14.2.3 pH
14.2.4 探针长度
14.2.5 探针浓度
14.2.6 (G＋C)含量
14.2.7 错配
14.2.8 探针的复杂性
14.2.9 黏性
14.2.10 甲酰胺
14.3 杂交温度
14.3.1 长探针的Tm值计算
14.3.2 寡核苷酸探针的Tm值计算
14.4 杂交和Northern分析
14.4.1 预杂交:滤膜处理
14.4.2 实验方案:预杂交(长探针)
14.4.3 探针变性
14.4.4 杂交
14.4.5 杂交后严格洗涤
14.5 参考文献
第15章 检测原理
15.1 基本原理
15.2 放射自显影
15.2.1 滤膜的处理
15.2.2 X射线胶片
15.2.3 安全灯
15.2.4 曝光时间
15.2.5 增感屏
15.2.6 荧光成像法
15.2.7 胶片预闪
15.2.8 暗盒的规格
15.2.9 显影与定影
15.2.10 放射自显影:推荐方案
15.3 非同位素方法
15.3.1 生物素
15.3.2 地高辛
15.3.3 荧光标记的核苷酸
15.3.4 直接酶标法
15.3.5 化学发光检测法
15.3.6 显色检测法
15.4 数字成像系统
15.5 参考文献
第16章 核酸酶保护法定量测定特定的mRNA
16.1 基本原理
16.2 基本方法
16.3 探针选择
16.4 优化建议
16.5 可能的困难
16.6 实验方案:S1核酸酶保护分析法定量转录产物
16.7 实验方案:RNase保护分析法定量转录产物
16.8 参考文献
第17章 核RNA分析
17.1 基本原理
17.2 转录速率的检测
17.3 实验方案:核逃逸实验(新生mRNA分析技术)
17.3.1 细胞收集及细胞核的制备
17.3.2 用NP-40缓冲液裂解细胞
17.3.3 细胞核制备的备选方案:从组织培养的细胞中分离易损细胞核
17.3.4 细胞核制备的备选方案:从完整组织中分离细胞核
17.3.5 转录物的标记
17.3.6 标记转录物的回收
17.3.7 靶DNA的制备
17.3.8 用于杂交的RNA的制备
17.3.9 杂交后的洗脱和检测
17.4 实验方案:核逃逸实验(备选方法)
17.5 实验方案:核酸酶保护和脉冲标记转录法
17.6 RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ活性的区分
17.7 提取用于稳态分析的核RNA
17.8 实验方案:直接分离核RNA
17.9 实验方案:从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA
17.10 参考文献
第18章 cDNA合成
18.1 基本原理
18.2 cDNA合成概述
18.2.1 第一链合成的注意事项
18.2.2 第二链合成的注意事项
18.3 核定cDNA合成的效率
18.4 连接的注意事项
18.5 参考文献
第19章 反转录聚合酶链反应
19.1 基本原理
19.2 聚合酶链反应概述
19.3 反转录聚合酶链反应基本方法
19.4 实验室设计
19.5 引物设计
19.5.1 基本标准
19.5.2 Tm值
19.6 优化程序
19.7 PCR产物的分析
19.8 RT-PCR质量监控点
19.9 相关技术
19.9.1 cDNA 5′末端快速扩增PCR
19.9.2 cDNA 3′末端快速扩增PCR
19.9.3 巢式PCR
19.10 实验方案:cDNA第一链的合成
19.11 实验方案:PCR反应扩增cDNA
19.12 PCR产物的克隆
19.13 实验方案:平末端PCR产物的末端加A
19.14 实验方案:TA克隆的连接反应
19.15 TOPO克隆
19.16 参考文献
第20章 定量PCR技术
20.1 基本原理
20.2 灵敏度指标
20.3 定量方法
20.4 内源参照物
20.5 外源参照物
20.6 对照反应的规划
20.7 关于负对照
20.8 竞争PCR的关键因素
20.9 竞争PCR的主要步骤
20.10 实验方案:竞争PCR
20.10.1 非同源竞争模板的合成
20.10.2 第一链cDNA的合成
20.10.3 竞争PCR(初级扩增)
20.10.4 竞争PCR(次级扩增)
20.11 关于图像分析的考虑
20.12 竞争PCR的问题解答
20.13 实时PCR
20.14 参考文献
第21章 转录差减法
21.1 基本原理
21.2 关键问题
21.3 差减-校正PCR
21.4 非PCR差减
21.5 差减法的问题与解决办法
21.6 参考文献
第22章 mRNA差异显示
22.1 基本原理
22.2 一般过程
22.3 产物的多样性:预期得到什么
22.4 实验方案:mRNA差异显示
22.4.1 cDNA的合成
22.4.2 通过PCR扩增cDNA的各个组分
22.4.3 PCR产物分析
22.5 实验方案:差异表达序列的鉴定和筛选
22.6 用亲和俘获回收差异表达的序列
22.7 PCR产物的克隆
22.8 差异表达的验证
22.9 进一步的鉴定
22.10 差异显示的应用
22.11 mRNA差异显示的问题与解决方法
22.12 参考文献
第23章 基因表达的高通量分析
23.1 基本原理
23.2 微阵列是什么
23.3 微阵列能做什么
23.4 微阵列不能做什么
23.5 微阵列分析的主要步骤
23.6 参比RNA
23.7 应用
23.8 参考文献
第24章 RNA干扰——目标基因的沉默
24.1 基本原理
24.2 重要的RNAi术语
24.3 RNAi是如何工作的
24.3.1 siRNA的导入途径
24.3.2 shRNA的导入方法
24.3.3 DNA指导的RNAi技术
24.3.4 siRNA导入哺乳动物细胞的技术
24.4 有效的siRNA设计
24.5 体外和体内的问题
24.6 参考文献
第25章 基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学
25.1 基本原理
25.2 重要术语
25.3 基因组与基因组学
25.4 转录组与转录组学
25.5 蛋白质组与蛋白质组学
25.6 生物信息学
25.7 参考文献
第26章 一个RNA范例
26.1 典型实验
26.2 灵敏度的问题
26.3 有待进行的
26.4 到哪儿去寻求帮助
尾声
智慧的结晶
附录
附录1 保存完整和准确的记录
附录2 储存液
附录3 苯酚的制备
附录4 溴化乙锭和SYBR绿溶液的处置
附录5 用DNase I去除RNA样品中的DNA
附录6 用RNase去除DNA样品中的RNA
附录7 甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子化
附录8 硅烷化离心管和玻璃器皿
附录9 分子生物学家的主流工具——离心法
附录10 胰蛋白酶消化贴壁细胞的方法
附录11 用盐析法分离高分子量DNA
附录12 从植物组织中分离RNA
附录13 电泳——原理、参数和安全
附录14 聚丙烯酰胺凝胶电泳
附录15 仪器、试剂和服务的供应商
附录16 SI词头
附录17 通用缩写
附录18 商标引用
术语表
索引