PCR polymerase chain reaction

目录
原理篇
第1章 PCR技术基本原理
1.1 基本原理
1.2 PCR反应动力学
1.3 PCR技术的特点
1.4 PCR反应体系的组成
1.5 PCR所需设备和器材
参考文献
第2章 PCR技术的发展
2.1 PCR新技术的发展
2.2 其他核酸扩增技术的发展
参考文献
第3章 PCR技术在医学研究领域中的应用
3.1 PCR在医学检验中的应用
3.2 对PCR技术医学应用的正确认识
3.3 PCR技术在医学应用中的管理
参考文献
操作方法/技术篇
第4章 常规PCR
4.1 常规PCR反应体系说明
4.2 PCR操作
4.3 PCR条件优化
参考文献
第5章 反转录PCR
5.1 RT-PCR原理
5.2 RNA的提取和纯化
5.3 RT-PCR的操作
5.4 衍生技术——基因表达系列分析
参考文献
第6章 实时荧光定量PCR
6.1 原理
6.2 实验操作与优化
6.3 实时定量PCR数据分析
6.4 qPCR的常用软件——Primer Express
6.5 qPCR仪的选择
参考文献
第7章 免疫PCR
7.1 原理
7.2 实验操作
7.3 条件优化
参考文献
第8章 利用PCR构建突变体
8.1 定点突变
8.2 随机诱变PCR
8.3 衍生技术
参考文献
第9章 未知序列的克隆
9.1 RNA连接酶介导的cDNA 5’末端快速扩增
9.2 单侧特异性引物扩增未知DNA序列
9.3 反向PCR
参考文献
第10章 其他医学领域常见PCR技术
10.1 PCR技术应用于病原微生物检测鉴定
10.2 遗传性疾病诊断的常用PCR技术
10.3 PCR技术在肿瘤方面的应用
10.4 甲基化特异性PCR
参考文献
第11章 PCR软件使用
11.1 Oligo 6的使用
11.2 PerlPrimer的使用
11.3 引物在线设计
常见问题解答
1 为什么完全没有PCR扩增产物?
2 为什么除目的条带外，还出现多条非特异扩增条带?
3 为什么目的条带未出现但有非特异扩增条带出现?
4 为什么PCR产物很少?
5 为什么同一批PCR反应中包括阴性对照在内的平行管出现相同的阳性结果?
6 为什么PCR产物出现片状拖带或涂抹带?
7 如何提高PCR的保真度?
8 如何减少PCR污染?
9 如何特异扩增极微量的目的基因片段?
10 如何确定最适退火温度?
11 如何进行长片段PCR扩增?
12 如何提高PCR的特异性?
13 RNA制备过程中如何避免RNase污染?
14 进行RNA相关实验时，塑料制品、玻璃和金属物品需要怎么处理?
15 什么时候需要分离mRNA?
16 如何判定分离的总RNA的纯度?
17 提取RNA时什么时候需要加入RNA载体?
18 如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA?
19 纯化的RNA样品如何保存?
20 组织和细胞样品如何收集和保存?
21 如何估计RNA的产量?
22 RNA制备过程中哪个环节要特别注意?
23 RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的值最低为多少，如果太低是不是会影响结果?
24 RT-PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?
25 如何选择RT-PCR的方法?
26 RT-PCR的常用内标β-actin和GAPDH的使用是否有选择性，比如不同的细胞、不同的刺激?
27 如何确定PCR的线性期?
28 引物的特异退火温度怎样设定?是否可以根据GC和AT含量算出?是否可以用引物报告单上的〓值?
29 PCR时20μL体系中cDNA应加多少比较合适?MgCl?应加多少?各个成分的量有无确定标准?20μL是指体积还是量?
30 PCR结果进行电泳，actin有，但无其他目的条带，有几种原因?是否与cDNA的量少有关?Mg2?太多是否会抑制Taq酶的活性?
31 RT-PCR的引物如何设计?
32 如何确认RNA的质量?
33 RT-PCR中的定量如何控制?
34 RT-PCR的实验设计需注意哪些事项?
35 RT-PCR结果可以代替蛋白表达的结果吗?
36 DNA残留是否会影响RT-PCR?
37 RT-PCR定量测定中产物长度是否有限制?
38 RT-PCR中内参照的意义是什么?
39 RT-PCR中应选择什么作为内参照?
40 RT-PCR定量实验中的凝胶成像要注意什么?
41 提取RNA时沉淀RNA步骤要注意什么?
42 RNA的保存要注意什么?
43 从临床样品中提取RNA有哪些注意事项?
44 PCR基因诱变的意义是什么?
45 定点突变时，转化率低或仅能得到很少菌落怎么办?
46 怎么解决定点突变中低突变率的问题?
47 如何避免PCR定点诱变中出现的假阳性问题?
48 怎样控制PCR随机基因突变的突变率?
49 在随机突变PCR后，看不到目的DNA产物条带怎么办?
50 QF-PCR实验中无〓值(信号)出现是什么原因?
51 QF-PCR中〓值出现过晚是什么原因?
52 QF-PCR中标准曲线的线性关系不佳是什么原因?
53 QF-PCR中阴性对照也出现明显的扩增是什么原因?
54 QF-PCR中熔解曲线不止一个主峰是什么原因?
55 QF-PCR中扩增效率低是什么原因?
56 QF-PCR中实验重复性不好是什么原因?
57 如何知道QF-PCR中变性温度是否合适?
58 QF-PCR中如何选择变性时间?
59 QF-PCR中如何知道退火温度和时间是否合适?
60 QF-PCR中应该在哪一步读取荧光信号?
61 与常规的5'-RACE相比，RML-RACE有什么特点?
62 IPCR的主要用途是什么?
63 PCR-SSCP实验中有哪些注意事项?
64 如何优化多重PCR反应?
65 原位PCR要注意哪些问题?
66 PCR测序实验要注意哪些事项?
67 MSP与常规PCR有何不同?
68 为何有些组织DNA样品在MSP中同时出现甲基化和非甲基化两种结果?
69 MSP中如何设置对照?
70 采用软件设计的引物是否一定比自己根据经验设计的引物好?
附录
附录1 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法
附录2 临床基因扩增检验实验室基本设置标准
附录3 临床基因扩增检验实验室工作规范