医学生物化学与分子生物学实验技术（第2版）

第 1章　如何在分子水平研究生命 ....... 1

第 1节分子实验技术简史 ...................... 1

第 2节分子实验技术体系...................... 4

一、生物分子的分析鉴定 ...................4

二、生物分子的人工合成 ...................5

三、生物分子的人工改造 ...................5

四、生物分子的功能研究 ...................6

第 3节分子实验技术应用 ...................... 7

一、电泳技术在临床检验中的应用...............................................7

二、 DNA重组技术在医药卫生领域的扩展 ...................................7

三、基因诊疗技术在未来医学的前景...............................................8

四、动物模型在医学研究中的重要地位.........................................................9

第 2章　从组织中分离纯化生物大分

子——大分子制备技术 .......... 10

第 1节材料预处理及细胞的分离 ........ 11

一、选择材料及预处理 .....................11

二、细胞的分离 .................................11

第 2节细胞破碎及细胞器分离 ............ 12

一、细胞的破碎 .................................12

二、细胞器的分离 .............................13

第 3节大分子的分离纯化与测定 ........ 13

一、蛋白质的分离纯化 .....................13

二、核酸的分离纯化 .........................14

三、蛋白质浓度的测定 .....................15

四、核酸的浓度、纯度及完整性

测定 .............................................17

第 4节生物大分子提纯后的处理 ........ 18

一、大分子样品的浓缩 .....................18

二、大分子样品的干燥 .....................18

三、大分子样品的保存 .....................19

第 5节实验练习 .................................... 20

一、蛋白质的盐析与透析 .................20

二、蛋白质含量测定 ........................21

第 3章　测定物质的吸收光谱——分光

光度技术 .................................... 24

第 1节　分光光度技术的基本原理 ........ 24

一、光的性质 .....................................24

二、光谱 .............................................25

三、 Lambert-Beer定律 .....................26

第 2节　分光光度计的基本结构 ............ 27

一、光源 .............................................28

二、分光系统 .....................................28

三、样品室 .........................................29

四、检测器 .........................................29

五、显示器 .........................................30

第 3节　常用分光光度计的使用方法 .... 30

一、 721型分光光度计 ......................30

二、 721e型分光光度计 ....................31

三、 722s型分光光度计 ....................31

四、 SP-756紫外 -可见分光光度计 ...31

第 4节　分光光度技术的应用 ................ 31

一、溶液的定性分析 .........................32

二、溶液的定量分析 .........................32

第 5节　实验练习 .................................... 33

一、蛋白质的定量测定 .....................33

二、脲酶 Km值测定 ..........................37

三、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） ...........................40

四、血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） ................................42

五、激素对血糖浓度变化的影响 .....43

六、血浆高密度脂蛋白 -胆固醇的测定 .........................................45

七、紫外分光光度法检测核酸的浓度及纯度 .............................46

第 4章　将混合物中各种组分分开——

层析技术 .................................... 48

第 1节　层析技术概述 ............................ 48

一、层析技术的形成和发展 .............48

二、层析技术的基本原理 .................49

三、层析技术的分类 .........................49

四、层析技术的基本要求 .................50

第 2节　吸附层析 .................................... 50

一、吸附层析的原理 .........................50

二、吸附层析的操作 .........................50

第 3节　分配层析 .................................... 52

一、纸层析的原理 .............................52

二、纸层析的操作 .............................52

第 4节　凝胶过滤层析 ............................ 54

一、凝胶过滤层析的原理 .................54

二、凝胶过滤层析的特征常数 .........54

三、凝胶过滤层析的常用介质 .........55

四、凝胶过滤层析的操作 .................56

五、凝胶过滤层析的应用 .................57

第 5节　离子交换层析 ............................ 57

一、离子交换层析的原理 .................57

二、离子交换剂 .................................58

三、离子交换层析的操作 .................59

四、离子交换层析的应用 .................61

第 6节　亲和层析 .................................... 61

一、亲和层析的原理 .........................61

二、亲和层析的操作 .........................62

第 7节　实验练习 .................................... 63

一、氨基酸的分离鉴定——纸层

析法 .............................................63

二、转氨酶的活性鉴定——薄层层析法 .............................................64三、核苷酸的分离——离子交换柱层析法 .........................................65四、胰蛋白酶的分离纯化——亲和层析法 .........................................67五、血清蛋白质的层析分离——分子筛层析法 .............................68

第 5章　分离带电颗粒的有效手段——

电泳技术 .................................... 69

第 1节　电泳技术概述 ............................ 69

一、电泳技术的形成和发展 .............69

二、电泳技术的基本原理 .................70

第 2节　影响电泳的因素 ........................ 71

一、溶液的 pH...................................71

二、缓冲液的离子强度 .....................71

三、电场强度 .....................................72

四、电渗作用 .....................................72

第 3节　常用电泳技术 ............................ 72

一、纸电泳和醋酸纤维素薄膜

电泳 .............................................72

二、凝胶电泳 .....................................73

三、等电聚焦电泳 .............................75

四、双向电泳 .....................................76

五、核酸电泳 .....................................77

六、印迹转移电泳 .............................79

第 4节　实验练习 .................................... 79

一、血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 .............................................79二、血清乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳 .................................81三、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳...........................................82四、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 .........83五、 DNA琼脂糖凝胶电泳 ...............86六、限制性内切酶对质粒 DNA酶切产物的电泳鉴定 .................87

VII …………

目　　录

第 6章　利用离心场沉降大分子——

离心技术 .................................... 90

第 1节离心技术的基本原理 ................ 90

一、颗粒沉降的原理 .........................90

二、沉降系数 .....................................91

三、相对离心力 .................................91

第 2节　离心机的类型及操作规程 ........ 91

一、离心机的类型 .............................91

二、制备型离心机 .............................92

三、分析型离心机 .............................94

四、离心操作的注意事项 .................94

第 3节　制备型超速离心的分离方法 .... 95

一、差速沉降离心法 .........................95

二、密度梯度区带离心法 .................95

三、等密度梯度区带离心法 .............96

第 4节　实验练习 .................................... 96

一、肝糖原的提取和鉴定 .................96

二、酪蛋白的制备 .............................97

三、动物肝脏 DNA的提取 ..............98

四、酵母 RNA的提取及成分

鉴定 ...........................................100

五、质粒 DNA的提取与鉴定 ........101

六、感受态细菌的制备及质粒

DNA的转化.............................104

七、蔗糖密度梯度离心分离

病毒 ...........................................106

第 7章　利用碱基互补探查核酸序列——分子杂交技术 ............ 109第 1节　核酸分子杂交的基本原理 ...... 109一、变性与复性 ...............................109二、建立在 DNA变性与复性基础上的核酸杂交技术 ...................110第 2节　核酸分子杂交的主要类型及程序 ...........................................111一、固相杂交的支持物...................111二、常用的转移方法 .......................112三、固相杂交的基本程序...............112四、固相杂交的主要类型 ...............113

第 3节　核酸探针的分类和标记 .......... 114

一、核酸探针的分类 .......................114

二、核酸探针的标记 .......................115

第 4节　实验练习 .................................. 117

一、 Southern杂交 ...........................117

二、 Northern杂交 ...........................118

三、组织原位杂交 ...........................120

四、斑点杂交 ...................................121

第 8章　微量 DNA的体外扩增——

PCR技术................................. 123

第 1节　 PCR技术概述 ......................... 123

一、基本原理 ...................................123

二、主要步骤 ...................................123

三、主要特点 ...................................124

第 2节　 PCR的反应体系及操作 ......... 125

一、 PCR反应体系 ..........................125

二、 PCR的操作及注意事项 ..........125

三、 PCR反应条件的优化 ..............127

四、 PCR产物的检测分析 ..............128

第 3节　 PCR的衍生技术 ..................... 128

一、逆转录 -PCR.............................128

二、实时荧光定量 PCR ..................129

三、特殊 PCR ..................................130

第 4节　 PCR技术的应用 ..................... 132

一、分子生物学领域 .......................132

二、临床医学领域 ...........................133

三、其他领域 ...................................134

第 5节　实验练习 .................................. 134

逆转录 PCR ......................................134

第 9章　阅读遗传天书的*步——测序技术 .................................. 137第 1节　 DNA测序的基本原理............ 137第 2节　 DNA测序的常用方法 ............ 138一、酶学法——双脱氧链终止法 .......................................138二、化学（裂解）法——Maxam-Gilbert测序法 ..........................140

三、酶学法与化学法的比较 ...........141第 3节 DNA测序自动化 .................... 143第 4节实验练习.................................. 144双脱氧链终止法测定 DNA序列 ....144

转基因技术 ........................... 147

第 1节转基因技术概述 ...................... 147

一、转基因动物技术的原理 ...........147

二、转基因动物技术的成果 ...........148

第 2节建立转基因动物的方法 .......... 149

一、目的基因的制备 .......................149

二、转基因动物的制备方法 ...........149

三、转基因小鼠 ...............................156

第 3节转基因动物的应用 .................. 156

一、研究基因的结构和功能及其表达与调控 ...............................156二、建立人类疾病动物模型...........157三、研究人类疾病基因治疗 ...........157四、利用转基因动物生产生物活性蛋白 ...................................157五、利用转基因动物生产人用器官移植的供体 .......................158六、利用转基因技术改良动物品种和生产性能.......................158第 4节转基因的安全性问题 .............. 159一、转基因生物的安全性 ...............159二、转基因食品的安全性 ...............159第 5节实验练习 .................................. 160

一、转基因动物技术中外源基因的制备 .......................................160二、显微注射...................................161

第 11章　置换生物体的某种基因——基因打靶技术 ....................... 165第 1节基因敲除技术概述.................. 165一、基因敲除技术的建立和发展 ...........................................165二、基因敲除的基本原理...............167第 2节基因敲除的方法及进展 .......... 170

一、条件性基因敲除法 ...................170

二、诱导性基因敲除法 ...................171

三、利用*插入突变进行基因

敲除 ...........................................171

第 3节基因敲除小鼠的制备过程 ...... 174

一、目标载体的构建 .......................174

二、 ES细胞培养 .............................174

三、 ES细胞的转化 .........................175

四、挑克隆 .......................................175

五、抗性 ES细胞克隆的冻存 ........175

六、 ES细胞基因组 DNA的

提取 ...........................................175

七、克隆的分析和鉴定 ...................175

八、染色体分析 ...............................176

九、嵌合体小鼠的制备 ...................176

十、品系的建立 ...............................176

第 4节基因敲除技术的应用及缺陷 ... 177

一、基因敲除技术的应用 ...............177

二、基因敲除技术的缺陷 ...............178

第 12章　21世纪的生命科学技术——

蛋白质组学技术 ................... 180

第 1节　蛋白质组学概论 ...................... 180

一、蛋白质组学 ...............................180

二、蛋白质组学研究的策略和

范围 ...........................................182

三、蛋白质组学发展趋势 ...............182

第 2节　蛋白质组学技术 ...................... 183

一、样品制备 ...................................183

二、样品分离技术 ...........................184

三、样品鉴定技术 ...........................190

第 3节　蛋白质组生物信息学 .............. 195

第 4节　实验练习 .................................. 196

一、家兔血清蛋白质组二维凝胶

电泳技术的建立 .......................196

二、正常人尿蛋白质组学研究 .......198

第 13章　蛋白质与核酸相互作用分析——EMSA和 ChIP技术 .....200第 1节　电泳迁移阻滞实验（EMSA）... 200

目　　录

IX …………

一、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本原理 ...............................200二、电泳迁移阻滞实验（ EMSA）的基本操作步骤.......................200第 2节　染色质免疫沉淀（ ChIP）技术 .......................................... 202一、染色质免疫沉淀（ChIP）技术的基本原理 ...............................202二、染色质免疫沉淀（ ChIP）技术的基本操作步骤.......................202第 3节　实验练习 .................................. 204一、经 EMSA验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....204二、经 ChIP验证姜黄素可减少 B淋巴细胞核中 NF-κB的量 .....207

第 14章　蛋白质和蛋白质相互作用分析——酵母双杂交等技术 ....211第 1节　概述 .......................................... 211一、蛋白质相互作用的分子结构基础 ...........................................211二、蛋白质相互作用分析的意义 ...212三、相互作用蛋白质组学的研究技术平台 ...................................213

第 2节　酵母双杂交技术 ...................... 215一、酵母双杂交系统的原理...........215二、酵母双杂交系统的应用 ...........216三、酵母细胞内的高通量酵母

双杂交 .......................................216四、酵母双杂交系统的几个版本 ...216五、酵母双杂交系统的假阳性

问题 ...........................................217

第 3节　其他常用技术 .......................... 217一、细菌双杂交技术.......................217二、噬菌体展示技术 .......................218三、依赖亲和力筛选相互作用

蛋白质的技术 ...........................219

四、蛋白质芯片技术 .......................221

第 4节　实验练习 .................................. 222

一、酵母双杂交技术筛选 TRAC-1相互作用蛋白 ...........................222二、 GST融合蛋白沉降技术筛选RNF114相互作用蛋白 ............226

第 15章　科学发展的不竭源泉——技术创新 .................................... 230

第 1节　“三性”实验 ............................ 230一、“三性”实验的概念.................230二、“三性”实验的特点和意义 .....230三、实验教学体系的改革 ...............231四、“三性”实验的基本要求 .........232五、“三性”实验的一般程序 .........232六、“三性”实验的选题原则 .........232七、“三性”实验的实施及评估 .....233

第 2节　实验练习 .................................. 233

一、酵母蔗糖酶的纯化及性质研究 ...........................................233二、猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 ...........................................238三、 DNA重组实验.........................241

实验室管理 ...................................249

第 1节实验室规则 .............................. 249

第 2节实验用品的清洗 ...................... 250

一、玻璃仪器的清洗 .......................250

二、塑料器皿的清洗 .......................251

三、实验器皿的干燥与消毒 ...........251

四、常用洗涤液及其配制 ...............251

第 3节实验标本的制备 ...................... 252

一、血液样品的制备与保存 ...........252

二、尿液标本的收集与保存 ...........253

三、组织样品的制备与保存 ...........253

第 4节实验仪器的使用 ...................... 254

一、刻度吸管的使用 .......................254

二、微量进样器的使用 ...................255

三、单道可调式移液器的使用 .......256

四、蒸汽压力灭菌器的使用 ...........256

五、酸度计的使用 ...........................256

六、干燥箱和恒温箱的使用 ...........258

七、电热恒温水浴锅的使用 ...........259

第 5节实验数据的处理 ...................... 259

一、列表法 .......................................259

二、作图法 .......................................260

三、少量实验数据的处理 ...............261

四、实验误差和提高实验准确度

的方法 .......................................261

第 6节实验报告的书写 ...................... 263

一、实验记录 ...................................263

一、一般化学试剂的分级及配制的注意事项 ...............................264二、实验室中常用酸碱的密度和浓度...........................................266三、常用缓冲溶液及配制方法.......266四、溴化乙锭溶液的净化处理 .......271五、离心机转数与相对离心力的换算 ...........................................272六、硫酸铵饱和度的常用表...........273七、元素相对原子质量表 ...............275

二、实验报告 ...................................263参考文献...................................................277

第 7节常用实验数据 .......................... 264